Генная инженерия является совокупностью способов, приемов и технологий выделения из клеток или организма генов, получения рекомбинантных РНК и ДНК, осуществления различных манипуляций с генами, а также введения их и в другие организмы. Эта дисциплина способствует получению желаемых характеристик изменяемого организма.
Наукой в широком смысле генная инженерия не является, однако считается биотехнологическим инструментом. В ней применяются исследования таких наук, как генетика, молекулярная микробиология.
Созданные методы генной инженерии, связанные с управлением наследственностью, явились одним из самых ярких событий в развитии науки.
Ученые, молекулярные биологи, биохимики научились изменять, модифицировать гены и создавать абсолютно новые, сочетая гены от разных организмов. Также они научились и синтезировать материал в соответствии с заданными схемами. Искусственный материал ученые начали вводить в организмы, заставляя их работать. На всей этой работе основывается генная инженерия.
Однако существует некоторая ограниченность «биологического материала». Данную проблему ученые пытаются решить при помощи и Специалисты отмечают, что этот путь достаточно перспективен. В течение последних нескольких десятилетий учеными были созданы приемы, при помощи которых определенные клетки из растительных или можно заставить развиваться и размножаться независимо, отдельно от организма.
Достижения генной инженерии имеют большое значение. применяются в экспериментах, а также при промышленном производстве определенных веществ, которые невозможно получить при использовании бактериальных культур. Однако и в этой области имеют место трудности. Так, например, проблемой является отсутствие способности у клеток животных делиться такое же бесконечное количество раз, как
В ходе экспериментов были сделаны фундаментальные открытия. Так, впервые был выведен «химически чистый», изолированный ген. Впоследствии ученые открыли ферменты лигазы и рестриктазы. При помощи последних стало возможно разрезать ген на кусочки - нуклеотиды. А при помощи лигаз можно наоборот соединять, «склеивать» эти кусочки, но уже в новой комбинации, создавая, конструируя иной ген.
Значительных успехов добились ученые и в процессе «чтения» биологической информации. На протяжении многих лет расшифровкой заложенных в генах данных занимались У. Гилберт и Ф. Сенгер, американский и английский ученые.
Специалисты отмечают, что генная инженерия за весь период своего существования не оказала негативного воздействия на самих исследователей, не причинила вреда человеку и не принесла ущерба природе. Ученые отмечают, что достигнутые результаты как в процессе изучения функционирования механизмов, обеспечивающих жизнедеятельность организмов, так и в прикладной отрасли являются весьма внушительными. При этом перспективы представляются поистине фантастичными.
Несмотря на большое значение генетики и генной инженерии в сельском хозяйстве и медицине, главные ее результаты еще не достигнуты.
Перед учеными стоит достаточно много задач. Следует определить не только функции и назначение каждого гена, но и условия, при которых происходит его активация, в какие именно периоды жизни, под воздействием каких факторов, в каких именно участках организма он включается и провоцирует синтез соответствующего белка. Кроме того, немаловажно выяснить роль этого белка в жизни организма, какие реакции он запускает, выходит ли за клеточные пределы, какую несет информацию. Достаточно сложной является проблема сворачивания белков. Решение этих и многих других задач осуществляется учеными в рамках генной инженерии.
.(Источник: «Биология. Современная иллюстрированная энциклопедия.» Гл. ред. А. П. Горкин; М.: Росмэн, 2006.)
Смотреть что такое "генная инженерия" в других словарях:
Генная инженерия - раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием in vitro новых комбинаций генетического материала (рекомбинантной ДНК), способного к воспроизводству и функционированию в клетке хозяине. Источник … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации
То же, что генетическая инженерия … Большой Энциклопедический словарь
По определению ФЗ О государственном регулировании в области генно инженерной деятельности от 5 июня 1996 г. совокупность приемов, методов и технологий, в т.ч. технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по … Юридический словарь
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, методика создания молекулы ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), с желаемым геном, которая затем вводится в клетку бактерии, грибка (дрожжей), растения или млекопитающего с тем, чтобы она вырабатывала требуемый белок. Методика… … Научно-технический энциклопедический словарь
Раздел генетики, разрабатывающий приемы манипуляцй с НК и использующий эти методы для генетических исследований и получения организмов со смешанными геномами, в т. ч. полезных для медицины и народного хозяйства. (Источник: «Словарь терминов… … Словарь микробиологии
Генная инженерия - совокупность методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы;... Источник … Официальная терминология
генная инженерия - — Тематики биотехнологии EN biomolecular engineering … Справочник технического переводчика
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ - совокупность приемов, методов и технологий, в т.ч. технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых (РНК) и дезоксирибонуклеиновых (ДНК) кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие… … Юридическая энциклопедия
Термин генная инженерия Термин на английском genetic engineering Синонимы генетическая инженерия Аббревиатуры Связанные термины доставка генов, биоинженерия, биологические моторы, геном, ДНК, РНК, олигонуклеотид, плазмида, фермент, генная терапия … Энциклопедический словарь нанотехнологий
То же, что генетическая инженерия. * * * ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, то же, что генетическая инженерия (см. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ) … Энциклопедический словарь
генная инженерия - Gene Engineering Генная инженерия Технология рекомбинантных ДНК. Изменение с помощью биохимических и генетических методик хромосомного материала – основного наследственного вещества клеток. Хромосомный материал состоит из… … Толковый англо-русский словарь по нанотехнологии. - М.
Книги
- Генная инженерия в биотехнологии. Учебник , Журавлева Галина Анатольевна. Учебник`Генная инженерия в биотехнологии` подготовлен в соответствии с ФГОС ВПО по специальности 020400`Биология` и основан на лекциях, читаемых уже более 10 лет на биологическом факультете…
Генная инженерия
Материал из Википедии - свободной энциклопедии
Ге́нная инжене́рия - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.
Генная инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя исследования таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.
1 Экономическое значение
2 История развития и достигнутый уровень технологии
3 Применение в научных исследованиях
4 Генная инженерия человека
5 Примечания
7 Литература
Экономическое значение
Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путем использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.
Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов.
Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильно действующими ядами до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии.
Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля. Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы, способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы, использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы, термофильные бактерии, способные жить при температуре, как оказалось недавно, около 110 °C, и др.
И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений и животных. Это очень важный и перспективный путь, который также реализуется в биотехнологии. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Это было важное достижение - полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно.
[править]
История развития и достигнутый уровень технологии
Во второй половине ХХ века было сделано несколько важных открытий и изобретений, лежащих в основе генной инженерии. Успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была начата английским учёным Ф. Сенгером и американским учёным У. Гилбертом (Нобелевская премия по химии 1980 г.). Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках - это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов - химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.
Основные этапы решения генноинженерной задачи следующие:
1. Получение изолированного гена.
2. Введение гена в вектор для переноса в организм.
3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.
4. Преобразование клеток организма.
5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.
Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100-120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК, в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию. Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК, в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты - олигонуклеотиды. Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице веделенной из клеток РНК. Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага, в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК.
Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты - рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит также были удостоены Нобелевской премии (1978 г.).
Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффит открыл явление бактериальной трансформации. В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК, плазмидами. Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.
Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция.
Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование, т.е. отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с измененным генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идет о животных. В результате рождаются детеныши с измененным или неизмененным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.
Применение в научных исследованиях
Генетический нокаут. Для изучения функции того или иного гена может быть применен генетический нокаут. Так называется техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать последствия подобной мутации. Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, измененный так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Для получения нокаутных мышей полученную генноинженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки и замещают ею нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцисты суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.
Искуственная экспрессия. Логичным дополнением нокаута является искусственная экспресия, т.е. добавление в организм гена, которого у него ранее не было. Этот способ генной инженерии также можно использовать для исследования функции генов. В сущности процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.
Мечение генных продуктов. Используется, когда задачей является изучение локализации продукта гена. Одним из способов мечения является замещение нормального гена на слитый с репортерным элементом, например, с геном зеленого флуоресцентного белка (GRF). Этот белок, флуоресцирующий в голубом свете, используется для визуализации продукта генной модификации. Хотя такая техника удобна и полезна, ее побочными следствиями может быть частичная или полная потеря функции исследуемого белка. Более изощренным, хотя и не столь удобным методом является добавление к изучаемому белку не столь больших олигопептидов, которые могут быть обнаружены с помощью специфических антител.
Исследование механизма экспрессии. В таких экспериментах задачей является изучение условий экспрессии гена. Особенности экспрессии зависят прежде всего от небольшого участка ДНК, расположенного перед кодирующей областью, который называется промотор и служит для сязывания факторов транскрипции. Этот участок вводят в организм, поставив после него вместо собственного гена репортерный, например, того же GFP или фермента, катализирующего хорошо детектируемую реакцию. Кроме того, что функционирование промотора в тех или иных тканях в тот или иной момент становится хорошо заметным, такие эксперименты позволяют исследовать структуру промотора, убирая или добавляя к нему фрагменты ДНК, а также искусственно усиливать его функции.
[править]
Генная инженерия человека
В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.
Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия . Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребенок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей. При помощи генной инженерии можно получать потомков с измененной внешностью, умственными и физическими способностьями, характером и поведением. В принципе можно создавать и более серьезные изменения, но на пути подобных преобразований человечеству необходимо решить множество этических проблем.
Примечания
BBC News. news.bbc.co.uk. Проверено 2008-04-26 г.
Литература
Сингер М., Берг П. Гены и геномы. - Москва, 1998.
Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. - Москва, 1981.
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. - 1989.
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Генетическая инженерия, совокупность методов биохимии и молекулярной генетики, с помощью которых осуществляется направленное комбинированное генетической информации любых организмов.
Генетическая инженерия позволяет преодолевать природные межвидовые барьеры, препятствующие обмену генетической информацией между таксономически удаленными видами организмов, и создавать клетки и организмы с не существующими в природе сочетаниями генов, с заданными наследуемыми свойствами. Главным объектом генно-инженерного воздействия является носитель генетической информации - дизоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), молекула которой обычно состоит из двух цепей. Строгая специфичность спаривания пуриновых и пиримидиновых оснований обусловливает свойство комплементарности - взаимного соответствия нуклеотидов в двух цепях. Создание новых сочетаний генов оказалось возможным благодаря принципиальному сходству строения молекул ДНК у всех видов организмов, а фактически универсальность генетического кода обеспечивает экспрессию чужеродных генов (проявление их функциональной активности) в любых видах клеток. Этому способствовало также накопление знаний в области химии нуклеиновых кислот, выявление молекулярных особенностей организации и функционирования генов (в т. ч.установление механизмов регуляции их экспрессии и возможности подчинения генов действию «чужих» регуляторных элементов), разработка методов секвенирования ДНК, открытие полимеразной цепной реакции, позволившей быстро синтезировать любой фрагмент ДНК. Важными предпосылками для появления генетической инженерии явились: открытие плазмид, способных к автономной репликации и переходу из одной бактериальной клетки в другую, и явления трансдукции - переноса некоторых генов бактериофагами, что позволило сформулировать представление о векторах: молекулах - переносчиках генов. Огромное значение в развитии методологии генетической инженерии сыграли ферменты, участвующие в преобразовании нуклеиновых кислот: рестриктазы (узнают в молекулах ДНК строго определенные последовательности - сайты - и «разрезают» двойную цепь в этих местах), ДНК-лигазы (ковалентно связывают отдельные фрагменты ДНК), обратная транскриптаза (синтезирует на матрице РНК комплементарную копию ДНК, или кДНК) и др. Только при их наличии создание искусственных структур стало технически выполнимой задачей. Ферменты используются для получения индивидуальных фрагментов ДНК (генов) и создания молекулярных гибридов - рекомбинантных ДНК (рекДНК) на основе ДНК плазмид и вирусов. Последние доставляют нужный ген в клетку хозяина, обеспечивая там его размножение (клонирование) и образование конечного продукта гена (его экспрессию).
Принципы созд ания рекомбинантных молекул ДНК
Термин «Генетическая инженерия» получил распространение после того, как в 1972 П. Бергом с сотрудниками впервые была получена рекомбинантная ДНК, представлявшая собой гибрид, в котором были соединены фрагменты ДНК бактерии кишечной палочки, ее вируса (бактериофага a) и ДНК обезьяньего вируса SV40. В 1973 С. Коэн с сотрудниками использовали плазмиду pSC101 и рестриктазу (EcoRI), которая раскрывает ее в одном месте таким образом, что на концах двухцепочечной молекулы ДНК образуются короткие комплементарные одноцепочечные «хвосты» (обычно 4 - 6 нуклеотидов). Их называли «липкими», поскольку они могут спариваться (как бы слипаться) друг с другом. Когда такую ДНК смешивали с фрагментами чужеродной ДНК, обработанной той же рестриктазой и имеющей такие же липкие концы, получались новые гибридные плазмиды, каждая из которых содержала, по крайней мере, один фрагмент чужеродной ДНК, встроенной в EcoRI-сайт плазмиды. Стало очевидным, что в такие плазмиды можно встраивать фрагменты разнообразных чужеродных ДНК, полученных как из микроорганизмов, так и из высших эукариот.
Основная современная стратегия получения рекДНК сводится к следующему:
1) В ДНК плазмиды или вируса, способных размножаться независимо от хромосомы, встраивают принадлежащие другому организму фрагменты ДНК, содержащие определенные гены или искусственно полученные последовательности нуклеотидов, представляющие интерес для исследователя;
2) Образующиеся при этом гибридные молекулы вводят в чувствительные прокариотические или эукариотические клетки, где они реплицируются (размножаются, амплифицируются) вместе со встроенными в них фрагментами ДНК;
3) Отбирают клоны клеток в виде колоний на специальных питательных средах (или вирусов в виде зон просветления - бляшек на слое сплошного роста клеток бактерий или культур тканей животных), содержащие нужные типы молекул рекДНК и подвергают их разностороннему структурно-функциональному изучению.
Для облегчения отбора клеток, в которых присутствует рекДНК, используют векторы, содержащие один и более маркеров. У плазмид, например, такими маркерами могут служить гены устойчивости к антибиотикам (отбор клетик, содержащих рекДНК, проводят по их способности расти в присутствии того или иного антибиотика). РекДНК, несущие нужные гены, отбирают и вводят в реципиентные клетки. С этого момента начинается молекулярное клонирование - получение копий рек ДНК, а следовательно, и копий целевых генов в ее составе. Только при возможности разделения всех трансфицированных или инфицированных клеток каждый клон будет представлен отдельной колонией клеток и содержать определенную рек ДНК. На заключительном этапе производится идентификация клонов, в которых заключен нужный ген. Одна основывается на том, что вставка в рек ДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей его клетки (например, продукт экспрессии встроенного гена). В опытах по молекулярному клонированию соблюдаются 2 основных принципа: ни одна из клеток, где происходит клонирование рек ДНК, не должнаполучить более одной плазмидной молекулы или вирусной частицы; последние должны быть способны к репликации.
В качестве векторных молекул в генетической инженерии используется широкий спектр плазмидных и вирусных ДНК. Наиболее популярны клонирующие векторы, содержащие несколько генетических маркеров и имеющие по одному месту действия для разных рестриктаз. Таким требованиям, например, лучше всего отвечает плазмида pBR322, которая была сконструирована из исходно существующей в природе плазмиды с помощью методов, применяемых при работе с рекДНК; она содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, а также по одному сайту узнавания для 19 разных рестриктаз. Частным случаем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы, которые наряду с амплфикацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в реципиентных клетках. В ряде случаев молекулярные векторы могут обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса (их называют интегративными векторами).
Одна из важнейших задач генетической инженерии - создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных, которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов. Высокий уровень продукции белков достигается в том случае, если гены клонируются в многокопийных векторах, т. к. при этом целевой ген будет находиться в клетке в большом количестве. Важно, чтобы кодирующая последовательность ДНК находилась под контролем промотора, который эффективно узнается РНК-полимеразой клетки, а образующаяся мРНК была бы относительно стабильной и эффективно транслировалась. Кроме того, чужеродный белок, синтезируемый в реципиентных клетках, не должен подвергаться быстрой деградации внутриклеточными протеазами. При создании трансгенных животных и растений часто добиваются тканеспецифичной экспрессии вводимых целевых генов.
Поскольку генетический код универсален, возможность экспрессии гена определяется лишь наличием в его составе сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции, правильно узнаваемых хозяйской клеткой. Т. к. большинство генов высших эукариот имеет прерывистую экзон-интронную структуру, в результате транскрипции таких генов образуется матричная РНК-предшественник, из которой при последующем сплайсинге выщепляются некодирующие последовательности - интроны и образуется зрелая мРНК. Такие гены не могут экспрессироваться в клетках бактерий, где отсутствует система сплайсинга. Для того чтобы преодолеть это препятствие, на молекулах зрелой мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируют ДНК-копию (кДНК), к которой с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая цепь. Такие фрагменты ДНК, соответствующие кодирующей последовательности генов (уже не разделенной интронами), можно встраивать в подходящий молекулярный вектор.
Зная аминокислотную последовательность целевого полипептида, можно синтезировать кодирующую его нуклеотидную последовательность, получив ген-эквивалент, и встроить его в соответствующий экспрессирующий вектор. При создании гена-эквивалента обычно учитывают свойство вырожденности генетического кода (20 аминокислот кодируются 61 кодоном) и частоту встречаемости кодонов для каждой аминокислоты в тех клетках, в которые планируется вводить этот ген, т. к. состав кодонов может существенно отличаться у разных организмов. Правильно подобранные кодоны могут значительно повысить продукцию целевого белка в реципиентной клетке.
Значение генетической инженерии
Генетическая инженерия значительно расширила экспериментальные границы молекулярной биологии, поскольку стало возможным вводить в различные типы клеток чужеродную ДНК и исследовать ее функции. Это позволило выявлять общебиологические закономерности организации и выражения генетической информации в различных организмах. Данный подход открыл перспективы создания принципиально новых микробиологических продуцентов биологически активных веществ, а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены. Многие ранее недоступные биологически активные белки человека, в т. ч. интерфероны, интерлейкины, пептидные гормоны, факторы крови, стали нарабатываться в больших количествах в клетках бактерий, дрожжей или млекопитающих и широко использоваться в медицине. Более того, появилась возможность искусственно создавать гены, кодирующие химерные полипептиды, обладающие свойствами двух или более природных белков. Все это дало мощный импульс к развитию биотехнологии.
Главными объектами генетической инженерии являются бактерии Escherichia coli (кишечная палочка) и Bacillus subtilis (сенная палочка), пекарские дрожжи Saccharomices cereuisiae, различные линии клеток млекопитающих. Спектр объектов генно-инженерного воздействия постоянно расширяется. Интенсивно развиваются направления исследований по созданию трансгенных растений и животных. Методами генетической инженерии создаются новейшие поколения вакцин против различных инфекционных агентов (первая из них была создана на основе дрожжей, продуцирующих поверхностный белок вируса В человека). Большое внимание уделяется разработке клонирующих векторов на основе вирусов млекопитающих и использованию их для создания живых поливалентных вакцин для нужд ветеринарии и медицины, а также в качестве молекулярных векторов для генной терапии раковых опухолей и наследственных заболеваний. Разработан метод прямого введения в организм животных и человека рекДНК, направляющих продукцию в их клетках антигенов различных инфекционных агентов (ДНК-вакцинация). Новейшим направлением генетической инженерии является создание съедобных вакцин на основе трансгенных растений, таких как томаты, морковь, картофель, кукуруза, салат и др., продуцирующих иммуногенные белки возбудителей инфекций. генетический инженерия рекомбинантный молекула
Опасения, связанные с проведением генно-инженерных экспериментов
Вскоре после первых успешных экспериментов по получению рек ДНК группа ученых во главе с П. Бергом предложила ограничить проведение ряда генно-инженерных опытов. Эти опасения основывались на том, что свойства организмов, содержащих чужую генетическую информацию, трудно предсказать. Они могут приобрести нежелательные признаки, нарушить экологическое равновесие, привести к возникновению и распространению необычных заболеваний человека, животных, растений. Кроме того, отмечалось, что вмешательство человека в генетический аппарат живых организмов аморально и может вызвать нежелательные социальные и этические последствия. В 1975 эти проблемы обсуждались на международной конференции в Асиломаре (США). Ее участники пришли к заключению о необходимости продолжения использования методов генетической инженерии, но при обязательном соблюдении определенных правил и рекомендаций. Впоследствии эти правила, установленные в ряде стран, были существенно смягчены и свелись к приемам, обычным в микробиологических исследованиях, созданию специальных защитных устройств, препятствующих распространению биологических агентов в окружающей среде, использованию безопасных векторов и реципиентных клеток, не размножающихся в природных условиях.
Часто под генетической инженерией понимают только работу с рек ДНК, а как синонимы генетической инженерии используются термины «молекулярное клонирование», «клонирование ДНК», «клонирование генов». Однако все эти понятия отражают содержание лишь отдельных генно-инженерных операций и поэтому не эквивалентны термину «генетическая инженерия». В России как синоним генетической инженерии широко используется термин «генная инженерия». Однако смысловое содержание этих терминов различно: генетическая инженерия ставит целью создание организмов с новой генетической программой, в то время как термин «генная инженерия» поясняет, как это делается - путем манипуляции с генами.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Генная инженерия как раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых комбинаций генетического материала. История ее возникновения и развития, этапы генного синтеза. Безопасна ли генная модификация? Примеры ее применения.
реферат , добавлен 23.11.2009
Понятие и основные методы генной инженерии. Методика выделения ДНК на примере ДНК плазмид. Принципы действия системы рестрикции-модификации. Перенос и обнаружение клонируемых генов в клетках. Конструирование и введение в клетки рекомбинантных молекул ДНК.
реферат , добавлен 23.01.2010
Исследование сущности и предназначения генной инженерии - метода биотехнологии, который занимается исследованиями по перестройке генотипов. Метод получения рекомбинантных, то есть содержащих чужеродный ген, плазмид - кольцевых двухцепочных молекул ДНК.
презентация , добавлен 19.02.2012
Суть и задачи генной инженерии, история ее развития. Цели создания генетически модифицированных организмов. Химическое загрязнение как следствие ГМО. Получение человеческого инсулина как важнейшее достижение в сфере генно-модифицированных организмов.
реферат , добавлен 18.04.2013
Использование генной инженерии как инструмента биотехнологии с целью управления наследственностью живых организмов. Особенности основных методов и достижений генной инженерии в медицине и сельском хозяйстве, связанные с ней опасности и перспективы.
доклад , добавлен 10.05.2011
Генная инженерия как метод биотехнологии, который занимается исследованиями по перестройке генотипов. Этапы процесса получения рекомбинантных плазмид. Конструирование клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции.
презентация , добавлен 20.11.2011
Генная инженерия: история возникновения, общая характеристика, преимущества и недостатки. Знакомство с новейшими методами генной инженерии, их использование в медицине. Разработка генной инженерии в области животноводства и птицеводства. Опыты на крысах.
курсовая работа , добавлен 11.07.2012
Генетическая инженерия - инструмент биотехнологии для получения рекомбинантных РНК и ДНК, осуществления манипуляций с генами и белковыми продуктами, введения их в другие организмы. Современное состояние науки о наследственности и хромосомных болезнях.
реферат , добавлен 23.06.2009
Возникновение биотехнологии. Основные направления биотехнологии. Биоэнергетика как раздел биотехнологии. Практические достижения биотехнологии. История генетической инженерии. Цели, методы и ферменты генной инженерии. Достижения генетической инженерии.
реферат , добавлен 23.07.2008
Основы и техника клонирования ДНК. Этапы генной инженерии бактерий. Развитие генетической инженерии растений. Генетическая трансформация и улучшение растений с помощью агробактерий, источники генов. Безопасность генетически модифицированных растений.
Введение
В своей работе я раскрываю тему генной инженерии. Возможности, открываемые генетической инженерией перед человечеством, как в области фундаментальной науки, так и во многих других областях, весьма велики и нередко даже революционны.
Так, она позволяет осуществлять индустриальное массовое производство нужных белков, значительно облегчает технологические процессы для получения продуктов ферментации - энзимов и аминокислот, в будущем может применяться для улучшения растений и животных, а также для лечения наследственных болезней человека.
Таким образом, генная инженерия, будучи одними из магистральных направлений научно-технического прогресса, активно способствует ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сельскохозяйственная, энергетическая, экологическая.
Но особенно большие возможности генная инженерия открывает перед медициной и фармацевтикой, поскольку применение генной инженерии может привести к коренным преобразованиям медицины.
1. Сущность генетической инженерии.
1.1. История генной инженерии.
Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики.
На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу.
Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК.
С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.
На рубеже 50-60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально.
Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали кишечная палочка (E. Coli), ее вирусы и плазмиды.
Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов.
ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов.
В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.
Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа:
Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.
Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.
Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных.
Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг и С. Коэн с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.
1.2. Понятие о генной инженерии
Одним из разделов молекулярной генетики и молекулярной биологии, который нашел наибольшее практическое приложение, является генная инженерия.
Генная инженерия – это сумма методов, позволяющих переносить гены из одного организма в другой, или – это технология направленного конструирования новых биологических объектов.
Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства любого белка.
Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.
В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин.
Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100г кристаллического инсулина требуется 800-1000кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200-250грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков.
Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин.
Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается.
Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на 1 кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см.
Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы.
Компания «Genentec» в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР.
1.3. Цели и задачи генной инженерии
Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.
На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход «белок-ген», получивший название «обратная генетика». При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Таким способом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.
Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, передающие мутантный ген потомками.
Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах.
Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
·специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
·быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
·конструирование рекомбинантной ДНК;
·гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью;
·клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
·введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
2.
2.1. Выделение генов, содержащих необходимую информацию.
Получение генов возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментным синтезом и ферментным синтезом.
Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз, катализирующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклеотидные последовательности (4–7 нуклеотидных пар). Расщепление можно проводить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты ДНК имеют так называемые «тупые» концы. Возможно расщепление ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов. Образуемые при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие. Нуклеотидную последовательность с липкими концами можно присоединить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой), Превратить в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно комплиментарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать действие ферментов для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.
Химико-ферментный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одно цепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами, обычно 8–16-звенных. В настоящее время существуют «генные машины», которые под контролем микропроцессора очень быстро синтезируют специфические короткие последовательности одноцепочечной ДНК
Нужная последовательность оснований вводится на клавишный пульт управления. Микропроцессор открывает клапаны, через которые с помощью насоса в синтезирующую колонку последовательно поступают нукеотиды, а также необходимые реагенты и растворители. Колонка наполена бусинками кремния, на которых собираются молекулы ДНК. В данном устройстве возможен синтез цепей длиной до 40 нуклеотидов со скростью 1 нуклеотид за 30 минут. Полученные олигонуклеотиды с помощью ДНК-лигазы сшиваются между собой с образованием двуцепочечного нуклеотида. С помощью данного метода были получены гены А- и В-цепей инсулина, проинсулина, соматостатина и др.
Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК(мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом. Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присуттвует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в одобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния.
Метод с большим успехом применен для получения в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина). Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена. Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществляется в составе вектора. Вектор – это, как правило, кольцевая молекула ДНК, способная к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.
2.2. Подбор векторов (вирусы, плазмиды), способных к самостоятельной репликации в клетке реципиента.
Под понятием «вектор» понимается молекула нуклеиновой кислоты, способная после введения в клетку к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов репликации и транскрипции.
Векторные молекулы должны обладать следующими свойствами:
1) способностью автономно реплицироваться в клстке-реципиенте, то есть быть самостоятельным репликоном;
В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить на две группы: 1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена; 2) специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов. Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтез белковых продуктов клонированных генов. Векторы для экспрессии содержат последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток.
В качестве прокариотических векторов используются плазмиды, бактериофаги; в качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений, векторы на основе 2 мкм дрожжей и митохондрий и ряд искусственно сконструированных векторов, способных реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы).
Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках. Большинство плазмидных векторов получено на основе природных плазмид ColE1, pMB1 и p15A.
Бактериальные плазмиды делят на два класса. Одни плазмиды (например, хорошо изученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способны переходить из клетки в клетку, другие такой способностью не обладают. По ряду причин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генетического материала, подавляющее большинство бактериальных плазмидных векторов создано на базе плазмид второго класса. Многие природные плазмиды уже содержат гены, определяющие устойчивость клеток к антибиотикам (продукты этих генов - ферменты, модифицирующие или расщепляющие антибиотические вещества). Кроме того, в эти плазмиды при конструировании векторов вводятся дополнительные гены, определяющие устойчивость к другим антибиотикам.
На рис. 1 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E.coli - pBR322. Он сконструирован на базе детально изученной плазмиды E.coli - колициногенного фактора ColE1 - и содержит ориджин репликации этой плазмиды. Особенность плазмиды ColE1 (и pBR322 соответственно) состоит в том, что в присутствии ингибитора синтеза белка антибиотика хлорамфеникола (опосредованно ингибирующего репликацию хозяйской хромосомы) ее число в E.coli возрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку, что позволяет получать большие количества клонируемого гена. При конструировании вектора pBR322 из исходных плазмид был делегирован целый ряд «лишних» сайтов для рестриктаз.
В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для E.coli сконструированы плазмидные векторы для ряда других грамотрицательных бактерий (в том числе таких промышленно важных, как Pseudomonas, Rhizobium и Azotobacter), грамположительных бактерий (Bacillus), низших грибов (дрожжи) и растений.
Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов (до 10 тыс. пар оснований) геномов небольших размеров. Если же требуется получить клонотеку (или библиотеку) генов высших растений и животных, общая длина генома которых достигает огромных размеров, то обычные плазмидные векторы для этих целей непригодны. Проблему создания библиотек генов для высших эукариот удалось решить с использованием в качестве клонирующих векторов производных бактериофага l.
Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созданы на базе геномов бактериофагов l и М13 E.coli. ДНК этих фагов содержит протяженные области, которые можно делегировать или заменить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. При конструировании семейства векторов на базе ДНК l фага из нее сначала (путем делений коротких участков ДНК) были удалены многие сайты рестрикции из области, не существенной для репликации ДНК, и оставлены такие сайты в области, предназначенной для встраивания чужеродной ДНК. В эту же область часто встраивают маркерные гены, позволяющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора. Такие векторы широко используются для получения «библиотек генов». Размеры замещаемого фрагмента фаговой ДНК и соответственно встраиваемого участка чужеродной ДНК ограничены 15-17 тыс. нуклеотидных остатков, так как рекомбинантный фаго - вый геном, который на 10% больше или на 75% меньше генома дикого l фага, уже не может быть упакован в фаговые частицы.
Рисунок 1. Детальная рестрикционная карта плазмиды pBR322.
Таких ограничений теоретически не существует для векторов, сконструированных на базе нитчатого бактериофага М13. Описаны случаи, когда в геном этого фага была встроена чужеродная ДНК длиной около 40 тыс. нуклеотидных остатков. Известно, однако, что фаг М13 становится нестабильным, когда длина чужеродной ДНК превышает 5 тыс. нуклеотидных остатков. Фактически же векторы, полученные из ДНК фага М13, используются главным образом для секвенирования и мутагенеза генов, и размеры встраиваемых в них фрагментов намного меньше.
Эти векторы конструируются из реплекативной (двутяжевой) формы ДНК фага М13, в которую встроены «полилинкерные» участки (пример такой конструкции показан на рис. 5). В фаговую частицу ДНК включается в виде однотяжевой молекулы. Таким образом, этот вектор позволяет получать клонированный ген или его фрагмент как в двутяжевой, так и в однотяжевой форме. Однотяжевые формы рекомбинантных ДНК широко используются в настоящее время при определении нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера и для олигодезоксинуклеотид-направленного мутагенеза генов.
Перенос чужеродных генов в клетки животных осуществляется с помощью векторов, полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных - SV40, некоторых аденовирусов, вируса папиломы быка, вируса оспы и так далее. Конструирование этих векторов проводится по стандартной схеме: удаление «лишних» сайтов для рестриктаз, введение маркерных генов в области ДНК, не существенные для ее репликации (например, гена тимидин-киназы (tk) из HSV (вируса герпеса)), введение регуляторных районов, повышающих уровень экспрессии генов.
Удобными оказались так называемые «челночные векторы», способные реплицироваться как в клетках животных, так и в клетках бактерий. Их получают, сшивая друг с другом большие сегменты векторов животных и бактерий (например, SV40 и pBR322) так, чтобы районы, ответственные за репликацию ДНК, остались незатронутыми. Это позволяет проводить основные операции по конструированию вектора в бактериальной клетке (что технически намного проще), а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать для клонирования генов в животной клетке.
Рисунок 2. Рестрикционная карта вектора М13 mp8.
2.3. Получение рекомбинантной ДНК.
Суть конструирования рекомбинантных ДНК заключается во встраивании фрагментов ДНК, среди которых находится интересующий нас участок ДНК, в так называемые векторные молекулы ДНК (или просто векторы) - плазмидные или вирусные ДНК, которые могут быть перенесены в клетки про- или эукариот и там автономно репли-цироваться. На следующем этапе проводится отбор тех клеток, которые несут в себе рекомбинантные ДНК (с помощью маркерных признаков, которыми обладает сам вектор), и затем индивидуальных клонов с интересующим нас сегментом ДНК (используя признаки или пробы, специфичные для данного гена или участка ДНК).
При решении ряда научных и биотехнологических задач конструирование рекомбинантных ДНК требует также создания систем, в которых обеспечивается максимальная экспрессия клонируемого гена.
Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК в векторные молекулы. В первом случае 3"-концы фрагментов ДНК, среди которых находится интересующий нас участок ДНК (ген или его сегмент, регуляторный район), с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной последовательностью (например, поли (Т)). 3"-концы линейной формы векторной ДНК тем же способом наращиваются комплементарной ей гомополинуклеотидной последовательностью (то есть поли (А)). Это позволяет соединить две молекулы ДНК путем комплементарного спаривания искусственно полученных «липких» концов.
Во втором случае «липкие» концы создаются с помощью расщепления молекул ДНК (как векторной, так и содержащей интересующий нас фрагмент) одной из эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Рестриктазы характеризуются исключительно высокой специфичностью. Они «узнают» в ДНК последовательность из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляют в них строго определенные межнуклеотидные связи. Поэтому даже в ДНК больших размеров рестриктазы вносят ограниченное число разрывов.
Третий способ представляет собой комбинацию двух первых, когда липкие концы ДНК, образованные рестриктазой, удлиняются синтетическими последовательностями (рис. 3).
Концы фрагментов ДНК можно превратить в «липкие», наращивая их двутяжевыми олигонуклеотидами («линкерами»), в состав которых входит участок узнавания рестрикта-
Рисунок 3. Схема конструирования рекомбинантной ДНК с помощью рестриктаз PstI и поли(G)- поли(С)-линкера.
зой. Обработка такого фрагмента данной рестриктазой делает его пригодным для встраивания в векторную молекулу ДНК, расщепленную той же рестриктаэой. Часто в качестве «линкера» применяются полинуклеотидные фрагменты, которые содержат специфические участки сразу для нескольких рестриктаз (их называют «полилинкерами»).
После встраивания чужеродной ДНК в вектор их ковалентное сшивание осуществляется ДНК-лигазой. Если же размер бреши в рекомбинированной молекуле превышает одну фосфодиэфирную связь, она застраивается in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo с помощью репарирующих систем клетки.
2.4. Введение рекомбинантной ДНК в клетку – реципиент
Перенос рекомбинантных ДНК осуществляется путем трансформации или конъюгации. Трансформация – это процесс изменения генетических свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК. Впервые она была обнаружена у пневмококков Ф. Гиффитом, который показал, что некоторые клетки невирулентных штаммов бактерий при заражении ими мышей совместно с вирулентными штаммами приобретают патогенные свойства. В дальнейшем трансформация была продемонстрирована и изучена у различных видов бактерий. Установлено, что к трансформации способны лишь некоторые, так называемые «компетентные», клетки (способные включать чужеродную ДНК и синтезирующие особый трансформирующий белок). Компетентность клетки определяется также факторами внешней среды. Этому может способствовать обработка клеток полиэтиленгликолем или хлоридом кальция. После проникновения в клетку одна из нитей рекомбиантной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком реципиентной ДНК может включиться в хромосому или внехромосомную единицу. Трансформация является наиболее универсальным способом передачи генетической информации и имеет наибольшее значение для генетических технологий.
Конъюгация – один из способов обмена генетического материала, при котором происходит однонаправленный перенос генетической информации от донора к реципиенту. Этот перенос находится под контролем особых конъюгативных плазмид (фактор фертильности). Перенос информации от донорской клетки в реципиентную осуществляется через специальные половые ворсинки (пили). Возможна передача информации и с помощью неконъюгативных плазмид при участии плазмид-помощниц.Передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию в клетке фаговых частиц, называется трансфекцией. Методика применительно к бактериальным клеткам включает получение сферопластов, очистку инкубационной среды от нуклеаз и добавление очищенной фаговой ДНК (присутствие протаминсульфата повышает эффективность трансфекции). Методика применима к животным и растительным клеткам с участием специальных челночных вирусных векторов.
3.
В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.
Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генно-инженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора. Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генно-инженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента. Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генно-инженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.
С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генно-инженерных вирусных векторов для исцеления взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) - игрунка обыкновенная.
Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия/ Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.
Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем.
Заключение
В результате интенсивного развития методов генетической инженерии получены клоны множества генов рибосомальной, транспортной и 5S РНК, гистонов, глобина мыши, кролика, человека, коллагена, овальбумина, инсулина человека и др. пептидных гормонов, интерферона человека и прочее.
Это позволило создавать штаммы бактерий, производящих многие биологически активные вещества, используемые в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности.
На основе генетической инженерии возникла отрасль фармацевтической промышленности, названная «индустрией ДНК». Это одна из современных ветвей биотехнологии.
Для лечебного применения допущен инсулин человека (хумулин), полученный посредством рекДНК. Кроме того, на основе многочисленных мутантов по отдельным генам, получаемых при их изучении, созданы высокоэффективные тест-системы для выявления генетической активности факторов среды, в том числе для выявления канцерогенных соединений.
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА:
1) Бекиш О.-Я.Л. Медицинская биология. – Мн.: Ураджай, 2000. – с.114-119.
2) Мутовин Г.Р. Основы клинической генетики. – М.: Высшая школа, 1997. – с. 83-84.
3) Заяц Р.С. Основы медицинской генетики. – Мн.: Высшая школа, 1998. – с. 60-65.
4) biotechnolog.ru
План:
Введение.
1.Сущность генетической инженерии.
1.1. История генной инженерии
1.2. Понятие о генной инженерии
1.3. Цели и задачи генной инженерии
2. Этапы создания организмов с генетически измененной программой.
2.1. Выделение генов (естественных или синтезированных), содержащих необходимую информацию.
2.2. Подбор векторов (вирусы, плазмиды), способных к самостоятельной репликации в клетке реципиента.
2.3. Получение рекомбинантной ДНК.
2.4. Введение рекомбинантной ДНК в клетку - реципиент.
3.Применение генно-инженерных технологий в медицине.
